飞行时间质谱MLDI的电离方式是Krs和Hillenkmp于1988年提出。MLDI的基本原理是将分析物分散在基质分子（酸及其同系物）中并形成晶体，当用激光37nm的氮激光）照射晶体时，基质分子吸收激光能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使样品分子发生电离。它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测定出其分子量，MLDI-TOF-MS般用于肽质量指纹图谱，非常快速（每次分析只需3~5min），灵敏（达到fmol水平），可以测量肽段质量，但是如果在分析前不修饰肽段，MLDI-TOF-MS不能给出肽片段的序列。